保健食品保健品蜂产品蜂胶蜂王浆蜂蜜螺旋藻保健酒功能食品减肥减肥茶芦荟制品提取物松花粉亚麻酸
摘要：目的：探讨酒精性肝损伤肝细胞形态与功能变化的特征，以及中药对酒精性肝损伤的防护作用机理。方法：首次采用激光共聚焦扫描显微分析技术，对灌胃二锅头白酒复制的大鼠酒精性肝损伤模型进行了肝细胞形态、肝细胞内DNA与RNA含量变化分析。结果：灌胃白酒可导致严重的肝细胞代谢及形态异常，细胞内DNA和RNA代谢性损害，细胞平均周长、面积均显著大于正常状态，呈现为肝细胞肿胀，甚至肝细胞死亡。解酒口服液对酒精所致的上述形态与功能改变有显著的良好影响。
大量酒精摄入后可引起机体多系统损害，肝脏是酒精代谢的主要脏器。以往研究多重视酒精性肝损伤肝脏病理形态学改变，而对肝细胞形态结合功能改变的研究尚未见报道。本实验运用激光共聚焦扫描显微分析技术，进行酒精中毒大鼠肝细胞形态及DNA、RNA含量变化分析，揭示酒精中毒大鼠肝细胞形态与功能损伤的特征。并探讨中药复方制剂-解酒口服液(葛花、枳?FDA2?子、黄连、砂仁等)对酒精性肝损伤的防护作用机制。
纯系Wistar雌性大白鼠(中国中医研究院动物中心提供)15只，体重170g～190g。随机分为正常组、模型组和治疗组，每组5只。各组动物于实验环境普通饲料喂养1周后进行实验观察。治疗组灌胃解酒口服液(北京中医药大学东直门医院制剂室生产)16.25g/kg体重，正常组和模型组灌胃等体积生理盐水。1h后，治疗组和模型组以56度二锅头白酒14ml/kg体重灌胃，正常组灌胃等体积10%的葡萄糖溶液，各组动物连续灌胃10d，于末次给酒后空腹24h灌流取肝组织。
将大鼠以1%戊巴比妥钠腹腔注射(40mg/kg体重)麻醉后，打开胸腔暴露心脏，剪开心包膜，迅速剪破右心耳，将灌流针头插入主动脉中灌入37℃生理盐水200ml，60s灌完，冲净体内血液。立即取肝门、肝右叶肋缘处肝组织，置于0.1M磷酸缓冲盐溶液(PBS pH7.2)中，以组织剪剪碎肝组织。于离心管中以吸管反复吹打组织约50次。继以800转/分钟离心1min，取第2次离心之沉淀物涂于洁净载玻片上，置95%预冷(4℃)，乙醇中固定10min，吖啶橙(AO，Serva产品)染色(随时在01ympus荧光显微镜下观察至鉴别DNA和RNA清楚为止)。然后，以ACAS激光共聚焦扫描显微镜(美国Meridian公司)观察分析。双染样本检测分析软件，蓝光激发(B，波长488nm)，阻挡滤片为530/30Bp和630/30Bp。功率100mW，扫描强度20%，Pihhole 800um，PMT1为39.2%，PMT2为39.4%，Sample Point为3%。
每组动物肝细胞涂片随机选取20个视野在以上参数下观察、存储、分析，计算肝细胞平均周长、面积和DNA、RNA荧光强度。
将肝细胞的形态表现大致分为三类。一类为正常细胞(A类)，染为黄绿色的DNA集中分布于细胞核中，染为橘黄、橘红色的RNA均匀分布于胞质中，核仁中的RNA染色常被DNA染色遮盖而不清晰，细胞核DNA荧光分布地形图如图1。另一类为严重受损的肝细胞(B类)，染为黄绿色的DNA呈数个团块散布于胞质接近胞膜处，已看不到DNA密集的细胞核，橘黄或橘红色的RNA稀疏，呈现为死亡的征象，DNA分布地形图如图2。还有一类是介于前两类之间的肝细胞(C类)，表现为DNA相对集中存在于胞核中，但有轻度偏位和松散征象，DNA分布地形图如图3。RNA较浓密，但与正常肝细胞比较略显分布不均，且胞质增厚，呈轻度肿胀征象，是一种受损但仍保持生理机能的细胞。
图像分析细胞分类发现，正常组以A类细胞为主，偶可见C类细胞，几乎无B类细胞；模型组以B类和C类细胞为主；治疗组则依A、C、B类依次减少(如表1所示)。比较三组各类细胞平均百分率的差别，模型组A类细胞显著少于正常组，解酒口服液治疗组与正常组比较虽有一定差别，但A类细胞百分率极显著地高于模型组。该结果表明，灌胃白酒可导致严重的肝细胞代谢及形态异常，甚至肝细胞死亡。解酒口服液能够有效地保护肝细胞，抑制酒精所致的肝细胞代谢损害，减少肝细胞死亡。
DNA和RNA综合平均荧光强度值间接反映其相对含量。比较三组该参数的差别，模型组显著低于正常组和解酒口服液治疗组(P＜0.01)，如表2所示。结合前述肝细胞形态分析，酒精可导致肝细胞DNA和RNA代谢损害，使之在肝细胞内的含量减少，而解酒口服液不仅可阻止酒精的这种损害作用，并且还能提高肝细胞DNA和RNA的含量。
肝细胞平均周长和平均面积反映肝细胞的平均大小(如表2所示)，模型组肝细胞平均周长、面积均显著大于正常组(P＜0.01)，解酒口服液治疗组虽也大于正常组，但显著小于模型组(P＜0.01)。提示解酒口服液可显著减轻酒精损害所致的细胞肿张。
激光共聚焦显微分析技术是近年来进行细胞形态与功能学一体化分析的最先进的实验分析技术。它不仅能反映细胞的形态结构参数，而且能表示细胞内物质代谢如线粒体摄取钙离子、DNA和RNA代谢状态、离子强度和胞间通讯等功能的变化。
本实验首次运用该技术进行了肝细胞形态及DNA、RNA含量变化分析，客观反映了酒精对肝细胞形态及功能的损害特征。实验结果显示，灌胃酒精可导致严重的肝细胞损害，形态上表现为肝细胞胞浆增多而肿胀，RNA分布不均；肝细胞核内DNA聚集、松散或核崩解死亡。功能上则显示DNA和RNA含量显著减少，提示其代谢能力严重受损而下降。当然，本实验正常组也偶可见到肿胀细胞，可以认为这是正常动物肝细胞自身老化死亡的表现。
RNA参与主要的蛋白质合成途径，DNA则指导RNA合成和细胞分裂［1］。解酒口服液对上述酒精所致的肝细胞形态与功能改变有显著影响。它不仅能减轻肝细胞的肿胀，减少肝细胞死亡，还能够提高肝细胞内DNA和RNA的生物合成能力，对酒精引起的肝细胞DNA损伤有修复作用。从而，在分子水平分析了解酒口服液对酒精性肝损伤的防护作用。可见，解酒口服液对于受损肝脏维持其功能活动具有非常重要的临床意义，并提示其能够促进肝细胞再生。该结果与本课题系列研究中解酒口服液抗酒精引起的肝脏脂质过氧化损伤，稳定肝细胞膜结构，维持线粒体结构与功能的完整性，以及肝脏病理形态学结果具有同步性。有关内容另有专篇报道。
作者简介：王新月(1964-)，女，北京中医药大学东直门医院医学博士，副教授，从事急性酒精中毒及酒精性肝病的研究。
［1］郭仁，张和君，董德祥，等.分子细胞生物学［M］.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1993.42-71.
1.本文系本网编辑转载，转载目的在于传递更多信息，并不代表本网赞同其观点和对其线.如涉及作品内容、版权和其它问题，请在30日内与本网联系，我们将在第一时间删除内容或提供稿费！
一、请遵守中华人民共和国有关法律法规、《全国人大常委会关于维护互联网安全的决定》及《互联网新闻信息服务管理规定》。