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对中医调整色素扩张性皮肤病方剂69首举办企图机拆方排序，选出高频次闪现中药82味，寓目这些中药乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶和无细胞体系众巴色素自愿氧化天生黑素量的影响。结果显示11味中药乙醇提取物正在3个区别浓度对酪氨酸酶活性和黑素天生量呈剂量依赖性逼迫，个中白术、白僵蚕、藁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿叶对酪氨酸酶活性逼迫率与单体化合物熊果苷无统计学区别(P＞0.05)。进一步磋议这些中药的皮肤脱色机制与评估其临床利用代价是需要的。
酪氨酸酶(EC1.14.18.1)是黑素生物合成途径中的苛重限速酶［1，2］。大大批能使皮肤脱色的物质都通过逼迫该酶活性来阻滞皮肤黑素天生，属酪氨酸酶逼迫型皮肤脱色剂(depigmenting agent)［2，3］。近十年来，从微生物［4］和植物药［5～7］平分离自然的酪氨酸酶逼迫剂已获得人们的众数合心。它不光用于色素扩张性皮肤病(黄褐斑、斑点等)的临床调整，况且可用于化妆品使肤色增白。本磋议从古今中医调整色素扩张性皮肤病方剂中精选69首［8］举办拆方并将组药输入企图机排序，筛选出高频次应用中药82味，寓目这些中药乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶和无细胞体系众巴色素自愿氧化天生黑素量的影响。
1.1药材：测验用中药生药82味，按中药正在69首方剂中闪现频次由高至低顺次为：白芷(40.6%)、白附子(36.3%)、当归(34.8%)、白茯苓(23.3%)、白僵蚕(20.3%)、甘草(18.8%)、红花(17.4%)、白芍(17.4%)、白芨(17.4%)、川芎(15.9%)、赤芍(15.9%)、白蔹(15.9%)、白术(14.5%)、柴胡(14.5%)、香附(13.0%)、生地(10.1%)、薄荷(8.7%)、丹参(8.7%)、牡丹皮(8.7%)、藁本(8.7%)、女贞子、熟地、紫草、泽泻、细辛、旱莲草、何首乌、桃仁、鸡血藤、生山栀、荆芥、龙胆草、枸杞子、陈皮、菟丝子、郁金、白鲜皮、生大黄、炙大黄、茵陈、黄精、益母草、合欢花、广木香、独活、月季花、珍珠母、莪术、北沙参、防风、夏枯草、黄芩、浮萍、六月雪、白蒺藜、苍术、苦参、骨碎补、川乌、沙苑子、蛇床子、生商陆、炙商陆、苍耳草、透骨草、白薇、降香、乳香、羌活、覆盆子、重楼、茺蔚子、桂枝、荜茇、地肤子、土茯苓、桑椹子、八月扎、炙草乌、桔梗、柿叶(鲜)、马齿苋(鲜)。以上中药除鲜品为当地自采外，其余均为生品，由南京中医药大学中药学院王春根教学判断并供应。
1.2试剂和仪器：L-众巴，蘑菇酪氨酸酶(Sigma产物)；熊果苷(上海奥利精巧化工场供应)；其它试剂均为市售阐述纯。分光光度计(上海第三阐述仪器厂)。
2.1中药乙醇提取物的制备：中药生药破裂，称取细粉5 g，用90%的乙醇50～100 mL室温下密闭浸泡2周，并时时振荡。滤过除渣搜集乙醇提取液置滚水浴中，挥尽乙醇浓缩至稠膏状。用1 mL二甲基亚砜融解后置4℃冰箱冻存备用。临用时用磷酸缓冲液稀释至设定浓度。
2.2酪氨酸酶活性测定［5，9］：将中药提取物用0.2 mol/L pH6.8磷酸缓冲液1 mL稀释后与蘑菇酪氨酸酶1 mL(100单元)搀杂，25℃孵育10 min。参与0.15%L-众巴反响液1 mL，陆续孵育2 min，马上于分光光度计475 nm处测光摄取值A475。中药生药终浓度设定为：高(100 mg/mL)、中(50 mg/mL)、低(10 mg/mL)3个区别浓度。酪氨酸酶活性逼迫率按下列公式企图：
其它另取4个浓度(50、100、500、1 000 μmol/L)的熊果苷水溶液为药物组阳性对比。
2.3众巴色素自愿氧化天生黑素量的测定：参照Matsuda等报道本事并稍加改进［9］。先将蘑菇酪氨酸酶1 mL(100单元)与0.15%L-众巴反响液1 mL搀杂，25℃孵育5 min。再参与区别浓度中药1 mL，置25℃陆续孵育60 min。结尾用1 mol/L盐酸0.2 mL终止反响。将反响搀杂物离心3 000 r/min 15 min，弃上清液，浸淀物用6 mol/L盐酸洗1次，双蒸水洗2次，结尾用1 mol/L氢氧化钠3 mL填塞融解，离心团块，置400 nm处测光摄取值A400。黑素天生逼迫率用加药组A400占空缺对比组A400的百分率暗示，即
82味中药，仅有11味正在高、中、低3个浓度均对酪氨酸酶活性和玄色素天生量呈剂量依赖性逼迫，个中白术、白僵蚕、藁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿叶乙醇提取物对酪氨酸酶活性的逼迫率与熊果苷无统计学区别(P＞0.05)。详睹表1。对酶活性高浓度逼迫低浓度激活的有10味：白茯苓、甘草、白芍、细辛、苍术、生商陆、桂枝、北沙参、防风、荜茇。高浓度激活低浓度逼迫的有4味：白芷、生地、骨碎补、乳香。其余用意不彰彰。4种浓度的熊果苷均对酶活性呈逼迫用意，且100μmol/L时最高，逼迫率达67.86%；纵然升高熊果苷浓度也不行扩张其对酪氨酸酶的逼迫。
人们最早理解的皮肤脱色剂是分子构造与酪氨酸酶的底物好像的单酚类化合物氢醌［11］。经常一种酶的底物好像物常能逼迫该酶活性［12］，依照这个思绪又有很众能逼迫酪氨酸酶活性的单酚或众酚化合物接踵被发明［11］。但氢醌及其它酚类化合物的外用制剂化学本质不稳固易氧化变色，尚有惹起皮肤长远性白斑的讲演［11］，限定了这类药物的开垦和临床利用。1988年日本学者Akiu等从杜鹃花科植物熊果Arctostaphylos uva-ursi的叶平分离到一种具有脱色用意的单体物质熊果苷(arbutin)，自此从微生物和植物药平分离自然酪氨酸酶逼迫剂惹起人们的趣味［11］。熊果苷是氢醌的一种自然存正在体式，氢醌-β-D-葡萄吡喃糖苷(hydroquinone-β-D-glucopyranoside)其脱色用意推断仍或许与分子构造中存正在的氢醌基团相合［1，3］。
本磋议利用企图机拆方排序对69首调整色素扩张性皮肤病的方剂组药举办阐述，依闪现频次筛选出中药82味，寓目这些中药乙醇提取物对蘑菇酪氨酸酶和无细胞体系众巴色素自愿氧化天生黑素量的影响。从表1可看出11味中药对酪氨酸酶呈逼迫用意，个中白术、白僵蚕、藁本、白芨、白附子、沙苑子、六月雪、柿叶乙醇提取物对酪氨酸酶活性的逼迫率与熊果苷无统计学区别(P＞0.05)，且黑素天生量减低与酪氨酶活性逼迫干系。11味中药有7味排序正在前20位，占63.64%。而排序居第一位的白芷则对酪氨酸酶呈高浓度激活低浓度逼迫的双向用意。
日自己磋议发明伞形科(川芎、柴胡、防风、独活、羌活、藁本、当归、前胡)［5］、蓼科(大黄)［10］、杜鹃花科(熊果)［9］等植物有较高的酪氨酸酶逼迫用意。本测验仅发明伞形科藁本、柴胡、北沙参、防风和白芷对酪氨酸酶有逼迫，川芎、独活、羌活以及蓼科大黄则对酶呈激活用意，与日本学者讲演不相仿［5，10］，是否与药物应用浓度和产地原因区别相合?但咱们从表中不行发明这些具有酪氨酸酶逼迫用意的中药间存正在有植物分类学上的相干。
用蘑菇酪氨酸酶和无细胞众巴色素自愿氧化天生黑素系统大领域筛选皮肤脱色剂，本事简略牢靠。但蘑菇酪氨酸酶与哺乳动物细胞原因的酪氨酸酶终究存有区别［7］。用体外作育的人黑素细胞或B16F10鼠黑素瘤细胞进一步确认这些中药对黑素天生影响是有需要的。
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