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黑素是一种含氮的复合物，在黑素细胞特有的器官—黑素小体中合成。黑素细胞的主要功能是合成黑素，通过树突将黑素颗粒转运给周围的角质形成细胞，使皮肤维持正常的色泽，免受紫外线及光致癌因子的损害。国内外学者通过建立一系列黑素细胞培养模型对其进行研究，对黑素细胞的认识进入了一个新的阶段。本文就黑素细胞研究模型与进展进行综述和分析，并对其发展进行展望。
六十年代以来，国内外学者致力于培养纯的黑素细胞，直到1982年Eisinger 等［1］在培养基中加入十四烷酰佛波醇乙酯（TPA）和霍乱毒素（CT）才首次成功地在体外培养出黑素细胞。但TPA是公认的强致癌剂，在体内不易代谢，长期作用于细胞可产生多种生物学效应。随着研究的深入，人们发现许多生长因子对黑素细胞有调节作用，为黑素细胞培养方式的改进提供了理论基础。1988年Halahan等［2］发现碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可刺激黑素细胞生长，随后Imokawa、Horkawa、 Halahand等发现bFGF/肝细胞生长因子（HGF）/扩散因子（SF），内皮素-1（ET-1）/HGF/SF，bFGF/ ET-1配伍可代替TPA和CT的协同作用，在不加其他刺激因子的情况下均可使黑素细胞良好生长。上述这些配伍因子均为体内正常情况下存在的生长因子，这使得培养出的黑素细胞与体内黑素细胞的特性更加接近，因而更适合于体外黑素细胞的药物实验［3］。
体外黑素细胞的培养成功，使人们对退色剂的研究进入了快速发展的阶段。因其具有方便、经济、快捷地筛选退色剂的作用，已成为当前研究退色剂的主要方法。然而这种黑素细胞的单独培养未考虑体内其它邻近细胞对黑素细胞的影响，并且培养的黑素细胞的生物学行为很大程度上依赖于一系列细胞因子的作用，与体内环境有很大的差异，所以它只能作为退色剂、化妆品的初步筛选。
成熟的黑素细胞位于上皮细胞的基底层，与周围的角质形成细胞紧密接触形成“表皮黑素单元”。角质形成细胞通过分泌白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素（IL-6）、肿瘤坏死因子（TNF-ａ）、ET-1等细胞因子影响黑素细胞的行为，调节黑素的合成，并且角质形成细胞与黑素细胞可通过细胞间的直接接触来影响黑素细胞的行为。由于角质形成细胞在“表皮黑素单元”中的重要作用，人们采用角质形成细胞与黑素细胞体外混合培养的方式模拟体内“表皮黑素单元”的功能，来研究黑素生成的机理及退色剂的作用机制。1994年Regnier M等［4］通过角质形成细胞与黑素细胞的混合培养发现可形成类似“表皮黑素单元”的结构，为研究角质形成细胞与黑素细胞相互作用机制提供了模型。
目前，角质形成细胞与黑素细胞的混合培养存在两种方式，一种为角质形成细胞与黑素细胞用微孔膜隔开培养。2003年J-F Nicolay等［5］在培养皿中用微孔多聚碳酸酯膜将角质形成细胞与黑素细胞隔开形成两个小室进行培养。其中角质形成细胞位于上层小室，黑素细胞位于下层小室，两种细胞分泌的细胞因子可通过微孔相互作用于对方，但两种细胞并不直接接触。另一种为角质形成细胞与黑素细胞直接接触培养。2000年Seiberg M等［6］将角质形成细胞与黑素细胞以10：3的比例混合培养，发现角质形成细胞上表达的蛋白激酶受体2可调节角质形成细胞对黑素小体的吞噬作用，而对照组采用将两种细胞用微孔膜隔开的培养方式则未发现这种现象。
角质形成细胞与黑素细胞直接接触的培养方式有所改进，但与黑素细胞在皮肤内的真实环境有很大的差异，而且两种混合培养方式中细胞均为浸没于培养基中培养，角质形成细胞不能角化形成正常的上皮结构。因此 只能作一些初步的筛选实验，且实验结果与临床有一定的出入。
随着时代的进步，人们对新开发的退色剂、化妆品的安全性和有效性的评估提出了更高的要求。传统的黑素细胞单纯培养及角质形成细胞与黑素细胞的混合培养不是未考虑角质形成细胞的作用，就是二者受到空间上的限制，与正常皮肤有较大的差异。人们迫切需要一种更好的体外模型来模拟正常皮肤的内环境，使实验结果与临床结果更趋于一致。随着生物工程技术的进步及人们研究的深入，逐步发展了以气-液平面技术来培养色素化皮肤。目前，色素化皮肤的培养方式大体可分为两类，一类是在去表皮的无细胞真皮上混合培养角质形成细胞与黑素细胞来构建色素化皮肤；另一类是在真皮替代物上混合培养角质形成细胞与黑素细胞来构建色素化皮肤。
去表皮的无细胞真皮是经过处理的真皮，去除其中的上皮细胞、成纤维细胞、微血管内皮细胞等存活的细胞成分及可溶性蛋白质，形成一个胶原纤维网架为主的真皮基质，以此作为角质形成细胞与黑素细胞混合培养的支持物［7］。这种方法中真皮的来源可以是异种皮（如猪皮）、也可以是异体皮。常用的处理方式主要有①平衡盐溶液法、②酶消化法、③高渗盐溶液-去污剂法来获得无细胞线）真皮替代物上构建色素化皮肤
真皮替代物最常用的是I型胶原与成纤维细胞相混合，经培养后形成三维结构。也有人在其中加入粘多糖、几丁糖、硫酸软骨素等细胞基质成分一起培养形成真皮基质以此作为角质形成细胞与黑素细胞混合培养的支持物［9］。
两种色素化皮肤的培养方法都是将角质形成细胞与黑素细胞以10：1的比例接种于真皮支持物上，待接种在真皮支持物的两种细胞融合后，通过用网架支撑使上皮细胞暴露于气-液平面进行培养，促使培养的细胞在这种条件下得以完全分化。用这种方法建立的皮肤模拟物具有与正常皮肤相似的形态学表现：出现了角质层、颗粒层、棘层、基底层，部分皮肤中在表皮与真皮交界处出现了类似线］。细胞表达的分化标志也与正常皮肤的生物学表现相似。色素化皮肤角化上皮的出现，使退色剂局部应用于上皮时，需要经过一个药物渗透通过角化上皮的过程后，一部分药物才能到达靶细胞，发挥药物的作用，这一过程与药物作用于正常皮肤的过程相似，使得这种体外实验结果与临床实验结果有较高的一致性；采用去表皮的无细胞真皮来构建色素化皮肤，这种真皮中不含可溶性蛋白质及任何活细胞，它的主要成分是胶原、弹性蛋白、蛋白多糖等不溶性基质成分，尤其是它保留了完整的基底膜，这对上皮细胞的黏附、生长、分化、以及真皮与表皮的连接起到了重要作用；而采用在真皮替代物上构建色素化皮肤的方法，其真皮支持物中含有活细胞成分如成纤维细胞，它可以定植于网架中，不断地分泌某些细胞因子及新生的胶原基质，对角质形成细胞与黑素细胞的行为起到调节作用［11］。
总之，这两种方法构建的色素化皮肤与正常皮肤的特性更为相似，为黑素细胞的体外生物学的研究、退色剂的筛选提供了更为科学的模型。但这两种方法构建的色素化皮肤也存在一些缺点：①实验药物对这两种方法构建的色素化皮肤的渗透能力比正常皮肤要高5~50倍，这可能是由于角化层中的化学成分与正常皮肤的差异所致。②这两种方法构建的色素化皮肤在体外培养6~7周后所有的迹象都表明上皮细胞的分化过程正常，在上皮细胞的分化过程中，角质层也在不断的形成，正常皮肤的这一过程被上皮细胞不断的脱屑所抵消，使角化上皮的厚度保持一定。但在模型中并未观察到这一现象，这使得它的角化上皮不断的增厚。③体外构建的色素化皮肤不能长期培养，在色素化皮肤构建成功培养几周后，所有的细胞都会表现出不同程度的老化现象［6］。④在实验中一些退色剂的效果竟与临床结果相反。2001年Kotar等［12］采用黑素细胞的单独培养、在真皮替代物上构建色素化皮肤两种模型来研究全反式维甲酸对黑素细胞的作用，结果未能在体外证实全反式维甲酸的退色作用。但全反式维甲酸在正常皮肤上的退色作用已得到证实，并已用于临床。这说明无论是黑素细胞的单独培养，还是色素化皮肤都与正常皮肤有所差异，其实验结果并不能完全等价于临床实验结果。
为了进一步研究黑素在体内的生成过程，人们构建了许多动物模型。尤其在鼠类中，已研究出大约100个与鼠类毛发着色直接或间接相关的基因，其中30个基因被克隆且功能已被阐明。Hirobe等［13］通过对C57BL/10JHir黑色小鼠与同属的携带野灰色、棕色、品红色及白化病基因的新生小鼠皮肤的原代培养，观察发现携带野灰色、棕色基因的小鼠黑素细胞中的优黑素含量分别为对照组C57BL/10JHir黑色小鼠的2/3、1/3；而另两种小鼠黑素细胞中的优黑素含量分别为对照组的0.5%,所有小鼠的褐黑素含量没有显著性差异。通过对不同基因的突变来研究它们在毛发、皮肤着色中的作用，阐明它们的作用机制。2004年Vincent等［14］将去表皮的无细胞真皮构建的人色素化皮肤成分，一部分采用气-液平面培养技术继续培养4周作为对照组，另一部分移植于Swiss nu/nu裸鼠上作为实验组。对照组在2周内上皮细胞分化良好，2周后基底层的黑素细胞数量减少，在第4周时上皮结构紊乱，在整个实验过程中真皮内未出现黑素细胞；实验组移植6周内肉眼观，移植物逐渐着色，镜下，11-16周内上皮细胞分化良好，但在上皮层中仅有数量很少的有功能的黑素细胞，真皮内有大量黑色素聚集物，一些黑素细胞迁移至真皮上部。
斑马鱼作为一种生物模型为研究色素细胞的发生调控机制提供了有利工具。斑马鱼的神经源性色素细胞包括黑素细胞、黄色素细胞、晕色素细胞。在成熟个体它们形成相间的色素带。其中黑素细胞和晕色素细胞形成黑色带，黄色素细胞与晕色素细胞形成浅色带。斑马鱼的胚胎发育过程在体外进行，大约24小时即形成脊椎动物的基本框架结构，至幼虫的早期阶段，它全身透明，由黑素细胞和晕色素细胞形成几条深色带，而黄色素细胞则散在分布于肋腹部。从卵到发育成成熟个体需6周时间，因而色素细胞在个体发育过程中易被识别、观察［15］。通过对斑马鱼的研究有利于我们认识色素细胞的分化机制及在基因水平上认识人类色素性疾病的发生、发展机制。
生物模型对我们研究色素细胞的发生、分化及色素性疾病的发病机制提供了有利手段。目前人类的一些色素性疾病已建立了相应的动物模型，由于它在生物体内进行干预措施，实验条件接近生理水平，能够获得较为准确的实验结果。
皮肤是一个由多种细胞构成的器官，这些细胞在调节黑素细胞的生长、形态、分化及色素化方面起着重要作用。内皮素-I是从内皮细胞中分离出来的一种具有21肽血管收缩肽，人类的黑素细胞具有高亲和性ET-I受体，ET-I具有促进人类黑素细胞的增殖和提高酪氨酸酶的活性［16］。在真皮的毛细血管中含有大量的内皮细胞，它们在特定的条件下可分泌一些细胞因子也可对黑素细胞的行为产生影响。1998年Black.A.F等［17］以乙酰壳多糖—I型、IV型牛胶原—糖胺多糖为骨架，将成纤维细胞与内皮细胞以1：1的比例混合培养在骨架，构建成真皮支持物，在其表面覆盖培养角质形成细胞，7天后，将培养物提升至气-液平面继续培养，14天后，发现该培养物的真皮支持物中有毛细血管样的结构形成称之为内皮化的皮肤模拟物，管壁周围的基底膜中有IV型胶原和层粘蛋白出现，管腔内有“白色同型血细胞”出现［18］。
当前应用于临床的组织工程皮肤（如：Integra、Apligraft 、Demagraft等［19］）中不含黑素细胞，移植后皮肤的颜色与周围皮肤的色泽有较大的差异，与美观不利。而且这种组织工程皮肤中没有血管系统供给营养，移植后又需要较长的时间才能使移植的皮肤血管化，表面上皮容易坏死脱落，移植的成活率低［19］。如果当真皮支持物中含有毛细血管网状结构时，受区的毛细血管长入移植物，与其中的毛细管网系统吻合，这将会缩短移植物血管化所需要的时间，提高组织工程皮肤移植的成活率；同时以其中存活的黑素细胞合成黑色素来协调移植皮肤的色泽，达到美观的效果。这种模型将会更接近于正常皮肤，使体外对黑素细胞行为的研究及退色剂的筛选结果更接进于临床实验。
能否建立黑素细胞、角质形成细胞、内皮细胞、成纤维细胞共存的三维培养方式，使这种模型更加接近人体的正常皮肤，为体外研究黑素细胞的行为、筛选更为安全有效的退色剂、组织工程皮肤移植成活率的提高及移植后美学问题的改善提供一条新途径，值得我们继续探索研究。
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