锌缺乏对小鼠脑发育及功能影响的实验研究

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单元：王福（水师医学第水师卫生学教研室）；赵法（第二军医大学卫生勤务学第部队卫生学教研室，上海200433）；郭俊生（第二军医大学卫生勤务学第部队卫生学教研室，上海200433）

摘要：宗旨：调查发育期（孕期和哺乳期）锌缺乏小鼠子代（成年）练习才华、海马长时程加强(LTP)、脑结构金属硫卵白（MT）及其mRNA的表达状况，开端商量发育期锌缺乏影响脑功效及发育的机制。设施：将80只刚孕珠ICR雌鼠随机分为5组：要紧缺锌、轻度缺锌、适锌、高锌对喂及高锌组，饲料含锌量区分为1，5，30，100及100 mg/kg。各组小鼠正在孕期和哺乳期均饲喂尝试饲料，仔鼠断奶（出生第20天）后改饲喂凡是饲料。70 d龄后，采用要求性回避反响模子测试仔鼠练习才华，然后正在其海马脑片进取行诱导LTP的尝试；采用Western blot和Northern blot工夫检测其脑结构中MT卵白及MT-ⅠmRNA表达状况。结果：轻度缺锌组仔鼠到达学会规范所需次数鲜明众于高锌组（P＜0.005），而其脑片上诱导的LTP却明显低于高锌组（P＜0.005）；脑结构中MT卵白及MT-ⅠmRNA表达量的序次为要紧缺锌组＜轻度缺锌组＜适锌组＜高锌对喂组＜高锌组。结论：发育期锌缺乏不单可形成练习才华降落、海马突触可塑性受损，同时还可使脑结构中MT卵白及其mRNA表达消重；MT卵白转录水准受阻或者是锌缺乏激励脑功效毁伤的紧张分子机制之一。 中图分类号：R 591.1文献标识码：A 作品编号：0258-879X(2000)01-0038-04

金属硫卵白（MT）是低相对分子质料（6 000～7 000）的锌联结卵白质。Ebadi等［1］酌量觉察大鼠脑MT正在发育历程中表达量发作厘革，提示其正在脑的发育中或者具有紧张心理功效。胚胎期和哺乳期是动物脑发育及功效酿成的紧张工夫，不良要素的影响可导致脑功效要紧缺损。有酌量报道动物孕期要紧锌缺乏（饲料含锌水准为1 mg/kg ）将导致子代大脑天才反常，孕后期至哺乳后期锌缺乏可惹起小鼠被动回避反响拙笨及影象才华的降落［2］。但相闭锌缺乏毁伤脑发育的机制目前还不非常知晓。极少酌量原料觉察如尝试动物只正在发育期饲喂缺锌饲料，动物成年时脑内锌水准并不低于饲喂寻常锌水准饲料的动物，但练习影象才华鲜明受损，提示锌缺乏激励脑功效毁伤的理由不行用脑内锌水准厘革来讲明［2］。那么这种脑功效毁伤是否与脑内紧张锌离子稳态调整卵白MT的表达量蜕变相闭？为了商量这个题目，咱们调查了正在母鼠孕期和哺乳期饲喂差异锌水准饲料的仔鼠的练习才华、海马脑片长时程加强(LTP)蜕变以及脑结构中MT及其Ⅰ型异构体（MT-Ⅰ）mRNA表达状况，为阐明缺锌影响脑发育的机制供应蓄志义的尝试原料。 1质料和设施

1.1尝试动物成年雌性ICR小鼠80只，由中国科学院尝试动物核心供应，体质料21～24 g。正在动物房凡是饲料豢养顺应1周。牝牡合笼，越日晨查有阴道栓即确认该雌鼠孕珠。孕珠母鼠按体质料随机分5组：要紧缺锌组（SZD)、轻度缺锌组(MZD)、适锌组(AZS)、高锌对喂组（HZP）及高锌组(HZS)，饲料含锌量区分为1，5，30，100及100 mg/kg。HZP组和HZS组母鼠喂饲的饲料相仿，含锌水准均为100 mg/kg；但管制HZP组的喂饲量，使其与SZD组母鼠的喂饲量相称。由于要紧低锌炊事可使动物食欲消重、摄食省略，设定HZP组是为解除因喂饲量差异而形成的对动物滋长发育的扰乱，使尝试结果只受锌水准影响［2］。各组动物正在受孕发轫至出生后第20天（20 d龄，P20）进食差异锌水准尝试饲料，21 d龄(P21）至成年（70 d龄，P70）各组尝试动物均改喂寻常饲料。记实尝试动物豢养期内体质料伸长状况。正在P70时对轻度缺锌组和高锌组仔鼠举行练习才华及海马LTP的测试；征采P70各尝试组仔鼠脑结构，每组6只，举行MT卵白及MT-ⅠmRNA检测。动物豢养正在塑料笼具内，自正在饮用双蒸水，照明周期为12 h/d，室温为21～25℃。 1.2尝试饲料动物饲以参照美国养分协会叙述的AIN-93G配方配制而成的纯化饲料［3］。配方中酪卵白经EDTA-Na2漂洗数次，以拂拭锌离子。配方不参预锌源为要紧缺锌饲料（饲料含锌量1 mg/kg），其他各组饲料按差异央求参预ZnCO3，使饲料锌水准区分到达5，30和100 mg/kg。饲料储存于－20℃备用。 1.3行径磨练及海马电心理记实行径磨练正在穿梭箱内举行［4］。该装备有两个室：一个室内小鼠承受电击，另一个没有电击。一盏40 W电灯行动要求刺激，正在灯光刺激后的5 s赐与电击（40 V DC），每分钟测试1次。众次磨练后小鼠能正在灯光刺激后的5 s内跑到另一室以遁避电击，为要求性回避反响。假使陆续10次测试中展现9次要求性回避反响，即以为小鼠依然学会。行径检测完了后，小鼠正在麻醉形态下剪头，取其右侧海马的中段，切成400 μm的脑片，举行脑片LTP诱导测定［5］。 1.4MT卵白的免疫印迹检测［6］取各组动物全脑，遵守1∶2（m/V）参预结构提取液（含EDTA 20 mmol/L, EGTA 10 mmol/L, PMSF 1 mmol/L, urea 2 mmol/L, DTT 1 mmol/L, Aprotinin 0.2 μg/ml的缓冲液，pH 7.6），冰浴超声匀浆，1.5×104 r/min 4℃离心5 min，取上清液举行乙醇重淀2次，Lowry法测定样品液卵白量。举行SDS-PAGE（15%）阔别，将卵白电移动至尼龙膜（Amersham）；封锁液室温封锁1 h，封锁液即含1％小牛血明净卵白（BSA,Sigma）和0.5％寻常羊血清（Gibco）的磷酸盐缓冲液；将封锁液倒净，加上稀释于封锁液中的第一抗体（兔抗大鼠MT，1∶500, Zymed），4℃歇宿；用漂洗液（即磷酸缓冲液中参预0.02% Tween-20和 0.5% BSA）洗膜10×3 min，洗去第一抗体，参预二抗（AP符号羊抗兔IgG, 1∶500，Zymed），室温下反响1 h；漂洗液洗膜10×2 min，洗去二抗，加NBT-BCIP显色液(75 mg/ml NBT, 50 mg/ml BCIP, 0.1 mol/L NaCl, 0.05 mol/L MgCl2, 0.1 mol/L Tris-HCl, pH 9.5，NBT，BCIP均为Sigma产物)避光反响，待所需条带清爽展现即终止反响，终止溶液为：20 mmol/L Tris-HCl, 1 mmol/L EDTA, pH 7.9。对尼龙膜举行摄影，并对条带举行密度扫描剖析。 1.5MT-ⅠmRNA的Northern 杂交检测大鼠肝MT-ⅠcDNA由美国Nebraska大学医学院Ebadi教员馈遗。用PSTⅠ酶切割含有大鼠肝MT-ⅠcDNA的pBR322质粒，举行α-32P-dATP符号。按旧例设施举行操作。将杂交膜用吸水纸吸干后压片，-80℃ 48 h。冲洗X线片，并举行密度扫描。 1.6统计学打点对行径学磨练及脑片LTP诱导结果采用t检查。

2.1锌缺乏对尝试仔鼠体质料伸长的影响各组尝试仔鼠的体质料伸长速率以HZS组最疾，SZD组最慢，其体质料伸长的速率按次为HZS组＞HZP组＞AZS组＞MZD组＞SZD组；成年时（P70）各组体质料区分为(36.57±6.57)，(34.48±5.41)，(32.37±3.50)，(27.11±2.65)及(22.19±3.21)g，SZD组和MZD组P70体质料区分为HZS组的60.7％和74.1％。可睹发育期锌缺乏可形成动物体质料伸长舒徐。 2.2锌缺乏对尝试仔鼠练习影象的影响孕期及哺乳期MZD组仔鼠到达学会规范所需的次数为(45.0±5.9,n＝7）鲜明众于HZS组的次数（34.7±3.9，n＝11），两组对比有明显性差异（P＜0.01）。 2.3锌缺乏对尝试仔鼠海马脑片LTP的影响母鼠孕期及哺乳期MZD组(n＝5）仔鼠海马脑片上诱导的LTP仅为（36.8±9.8）%，而HZS组(n＝6）的LTP为（70.5±14.9）% ，鲜明高于MZD组（P＜0.01）。该结果注脚，母鼠孕期及哺乳期轻度锌缺乏即能影响仔鼠海马的突触可塑性，而突触可塑性被以为是练习影象的神经根蒂。于是仔鼠练习才华的低下或者与突触可塑性的降落相闭。 2.4锌缺乏对尝试仔鼠脑结构MT表达的影响各尝试组仔鼠脑结构均有相对分子质料约为6 200的MT印迹展现（图1A），MT表达量的相对值区分为1（SZD组），2.41（MZD组），4.03（AZS组），4.74（HZP组）及5.15（HZS组），其MT表达量的序次阐扬为SZD组＜MZD组＜AZS组＜HZP组＜HZS组；SZD组MT表达量仅为HZS组的19.4%，MZD组MT表达量为HZS组的46.8%。 2.5锌缺乏对尝试仔鼠脑结构MT-Ⅰ mRNA表达的影响各组尝试仔鼠脑结构均有较激烈的MT-Ⅰ mRNA杂交条带展现（图1B），但各组MT-Ⅰ mRNA的表达量鲜明差异，即阐扬出HZS组＞HZP组＞AZS组＞MZD组＞SZD组，HZS组MT-Ⅰ mRNA表达的相对值是MZD组的3.63倍，是SZD组的5.78倍。提示动物发育期饲喂缺锌饲料可使其成年脑MT-Ⅰ mRNA的表达量鲜明省略。

微量元素锌紧要是以通过与酶联结的“Zn2+代谢库”、与酶以外卵白质联结的“Zn2+机闭库”以及突触内含有的“Zn2+囊泡库”等3种体例存正在于神经体例中。且锌离子正在脑内存正在区域性散布不同，其浓度以海马、视网膜、小脑及脑垂体为高。提示锌离子正在脑中或者阐扬紧张效用，为此很众学者开拓了锌与脑功效和发育的酌量［3］。本作事证据母鼠正在孕期和哺乳期饲喂轻度缺锌饲料，会惹起仔鼠展现练习影象才华（穿梭箱法）的降落，提示发育期（孕期和哺乳期）是锌缺乏形成练习影象才华低下的闭头工夫。 孕期缺锌而哺乳期自此饲喂含寻常锌水准饲料能够使海马的锌离子含量规复寻常［7］，那么此时的大脑海马是否有功效厘革？为此咱们对母鼠锌缺乏的仔鼠海马CA1区诱导的LTP举行了检测，觉察母鼠孕期和哺乳期轻度锌缺乏的仔鼠海马CA1区可诱导的LTP鲜明低于高锌组仔鼠脑片所诱导的反响，并觉察轻度缺锌仔鼠练习才华的低下与海马CA1区的LTP消重有平行联系，即正在练习才华好的小鼠海马CA1区诱导的LTP较高，表明母鼠孕期和哺乳期轻度缺锌的仔鼠练习才华的低下很或者是因为这暂时期的缺锌影响了海马的发育，从而使海马的突触可塑性消重，可睹防止孕哺期锌缺乏的紧张性。 以往极少酌量及咱们行径学和电心理一面酌量注脚，发育期锌缺乏可形成动物练习影象才华的降落。由于哺乳期自此饲喂寻常锌饲料可使动物海马锌离子含量规复寻常［7］，故这种脑功效的毁伤并不是因为成年时脑中锌水准低下形成，而或者是因为发育期缺锌形成中枢神经体例发育的受损，如咱们近期酌量觉察锌缺乏可惹起胚胎发育历程中表达于神经上皮细胞的巢卵白（nestin）、表达于神经元的神经微丝卵白（NF）以及表达于星形胶质细胞的胶质酸性纤维卵白（GFAP）等表达量厘革（待宣布）。Oteiza等［8］酌量觉察发育期轻度缺锌大鼠脑微管咸集效用消重。以上酌量结果提示，发育期锌缺乏正在生物体中枢神经体例发育早期已酿成不行逆的器质性或功效性毁伤。为进一步验证这个推理，咱们检测了成年尝试仔鼠脑结构中MT及其mRNA（MT-Ⅰ mRNA）的表达状况。结果觉察发育期锌缺乏可形成动物成年时脑MT及mRNA表达量鲜明降落，这种低表达量的MT或者与其生物体功效的毁伤存正在联络。极少学者以为脑MT是脑内“锌库”，中枢神经体例中锌离子正在调整兴奋性和制止性氨基酸受体离子通道等方面具有紧张效用，如Westbrook等［9］以为锌是极紧张的内源性谷氨酸受体调整剂；Forsythe等［10］觉察海马神经元中锌能阻滞N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体介导的兴奋性突触后电势。脑MT通过安谧锌浓度影响海马中氨基丁酸（GABA）的合成和NMDA受体的效用，从而介入海马苔藓纤维的突触通报行为，进而与脑功效间创设联络。脑中MT量降落，其调整锌离子稳态的才华一定受到影响，这或者是发育期锌缺乏毁伤脑功效的紧张机制所正在。酌量结果还提示锌正在转录水准即调控脑MT的表达。 巨额尝试注脚锌紧要是正在转录水准通过基因调整卵白对基因的特异表达举行调控的。目前觉察含锌基因调整卵白的锌联结位点起码有锌指（zinc finger）、锌簇（zinc cluster）和锌扭（zinc twist）三类机闭。锌和卵白质间的彼此效用有助于讲明锌正在生物体例的紧张功效。脑MT基因的表达与调控有着己方的很众特点，对脑MT基因表达调控及其与炊事锌联系的长远酌量，必将揭示出脑MT及其锌正在脑中的紧张功效。本酌量脑结构MT及其mRNA表达降落是发育期锌缺乏毁伤脑发育及功效的紧张机制之一，但缺锌-中枢神经体例发育-脑MT表达降落-脑功效受损之间的仔细机制有待进一步尝试酌量。■ 伸谢中国科学院上海心理酌量所梅镇彤酌量员、马晓峰博士及段书慧姑娘能手为尝试及电心理检测方面赐与了肆意协助，特此谢忱。

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